וולפנשטיין 3D הוא משחק יריות בגוף ראשון אפיזודי והמשך למשחק ההסתננות מלמעלה למטה Castle Wolfenstein. המשחק מכניס את השחקן לנעליו של ב.ג'. בלזקוביץ', מרגל בעל ברית. ישנם שישה פרקים: הראשון מופץ במלואו כשיתוף חינמי; השני והשלישי זמינים לאחר הרשמה; ושלוש המשימות האחרונות (שמתרחשות לפני אירועי הפרק הראשון) זמינות בחבילת המשימות הליליות.
בפרק הראשון (בריחה מוולפנשטיין), ב.ג'. נלכד, אך מתגבר על שומר בעזרת סכין מוסתרת ומצליח לצאת מתאו. לאורך תשעת השלבים הבאים השחקן מנחה את ב.ג'. בחיפוש אחר מילוט מוולפנשטיין, המוגן על ידי האנס גרוסה. לאחר חזרתו לשטח בעלות הברית, ב.ג'. מקבל הוראות למבצע: אייזנפאוסט, שם עליו לעצור את ד"ר שאבס ואת צבא אבות הטיפוס המוטנטים שלו לפני שהם משוחררים לשדות הקרב. המשימה הסופית (מות, פיהרר, מות!) יש לה מטרה פשוטה: להסתנן לבונקר מתחת לרייכסטאג, ולחסל את היטלר עצמו (בחליפה רובוטית).
המשימות הליליות מתמקדות בתוכניות הנאצים ללוחמה כימית, ומתחילות עם סוד אפל, שבו ב.ג'. צד את החוקר המוביל ד"ר אוטו גיפטמאכר. אחריו מגיע מסלול המטורף, שבו המטרה היא לתפוס את תוכניות המלחמה המוגנות על ידי גרטל גרוסה, והפרק הסופי עימות, שבו ב.ג'. פוגש את הגנרל פטגזיכט, המתכנן של ההתקפה הכימית.
לכל פרק יש תשעה שלבים (שמונה רגילים ושלב בוס סופי), בנוסף לשלב סודי המופעל על ידי מתג נסתר באחד משמונת השלבים הראשונים. שלבים רגילים לעתים קרובות מציגים מראה דמוי מבוך או אזורים גדולים עם אויבים רבים (מספרם בכל אזור תלוי ברמת הקושי), שבהם השחקן חייב להגיע למעלית היציאה. כדי לעשות זאת, עליו להרוג את האויבים (בעוד שאפשר לנוע מאחורי גבם של השומרים ואפילו יש בונוס קל בתקיפתם מאחור, רוב האויבים צריכים להתמודד איתם בכוח אש), ובהתאם לשלב, להפעיל "קירות דחיפה" ו/או להשיג מפתחות כסף וזהב לפתיחת דלתות מסוימות.
ניתן למצוא חפצים רבים בשלב, החל מערכות רפואה, ארוחות עוף, ואפילו מזון לכלבים (לשחזור בריאות), תחמושת ואוצרות, שקיימים אך ורק לצורך נקודות. ישנם ארבעה כלי נשק (סכין, אקדח, מכונת ירייה וגטלינג), כולם משתמשים באותם כדורים למעט הסכין. הסכין והאקדח ניתנים בתחילת השלב, בעוד שמכונת הירייה נמצאת (בדרך כלל באזורים סודיים) או נאספת מחיילי SS, והגטלינג תמיד מושלך באיזשהו מקום בשלב. ישנם חמישה סוגים של אויבים (למעט בוסים) – כלבים (מהירים, אך יותר מטרד מאשר מסכני חיים), חיילי צבא (לבושים במדים חומים רגילים, לא חזקים במיוחד אך בדרך כלל נמצאים בקבוצות גדולות), קצינים (לבושים בלבן, חמושים באקדח מדויק מאוד וקשים להריגה), חיילי SS (בגדים כחולים, חמושים במכונת ירייה וקשים להריגה), ומוטנטים (האויבים הרגילים הנדירים והקשים ביותר, חיילים חיוורים עם בגדים ירוקים ומכונת ירייה תקועה בחזה שלהם).
לדמות השחקן יש מספר חיים; ברגע שהוא מאבד את החיים האחרונים, המשחק מסתיים. כדי לזכות בחיים נוספים, השחקן צריך או למצוא את הפריט 1-up בשלב או להשיג 20,000 נקודות (על ידי הריגת אויבים ותפיסת אוצרות או השלמת שלב מתחת לזמן ה'פאר' תוך הריגת כל האויבים, מציאת כל הסודות על ידי דחיפת קירות, ואיסוף כל נקודות האוצר).